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细胞冻存实验的实验步骤
文章来源:江苏绿叶生物科技有限公司   添加时间:2020/3/10 8:32:34 点击率:26

实验原理:

在不附加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内外环境中的水会结成冰晶,能导致细胞发生一系列变化,如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变、蛋白质变性等等,终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使冰点降低,在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,可避免上述现象的发生。冻存在﹣135 ℃以下低温中,能减少冰晶的形成。而融化细胞时速度则要快,使之迅速通过易受损的-5~0 ℃以后,细胞活力不受损害,仍能生长增殖。当前常用的保护剂仍为甘油和DMSO,它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞,使用范围在5%~15 %之间,常用10 %。

实验步骤:

1.细胞

选项对数生长期细胞;收集细胞24 小时前换液一次。

2、制备细胞悬液:

(1)用75%酒精棉球消毒超净工作台台面,然后用75%酒精棉球消毒双手及暴露部位。

(2)用75%酒精棉球消毒各培养用液的瓶盖以及培养瓶瓶盖部位,并在酒精灯外焰上方一过,拧开瓶盖,将瓶口再在酒精灯外焰上方一过后,拧上瓶盖,但不要拧紧,以便下步操作。

(3)轻轻将细胞培养瓶内旧培养液倒入烧杯中,注意不要让瓶口碰到烧杯,不要让液体溅出。

(4)吸取PE液3ml加入瓶内,加入时注意从侧面加入而不能直接冲细胞贴壁处,避免造成细胞脱壁,然后盖上盖子,平放轻摇40下,轻轻倒出,要求倒干净。

(5)加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶液,加入时直冲细胞贴壁处,平放轻摇,使酶液漫过整个瓶底部,一分钟之内将培养瓶放在倒置显微镜台上进行观察,可发现细胞质渐渐回缩,细胞间隙增大,细胞慢慢变圆,用手掌拍打瓶底和瓶侧,使细胞从瓶壁上脱落下来并分散,呈悬浮状。

(6)立即加入5mlMEM+10%小牛血清,用吸管向瓶壁轻轻吹吸几次,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到,使细胞全部从瓶壁脱落并形成均匀的细胞悬液。

3、按常规法把细胞制成细胞悬液,计数、令细胞密度达5×106 /ml (如一瓶细胞数量不足则用两瓶或更多的细胞),离心去上清, 吸入离心管中;先用培养液9 分+DMSO 1 分(或甘油)配成10%的DMSO冻存液,按上法一滴滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬;分装入无菌安瓿中,每安瓿加1.5 毫升细胞悬液。

4、封口

用塑料安瓿时拧紧瓶口即可。如用火焰封闭安瓿口后,仔细检查,定要封严,必要时可浸入蓝色液中观察,为安全起见,把安瓿缝入纱布小袋中,以防液氮浸入后,融解时因受热发生爆炸伤人。纱袋一端系以线绳,末端扎有小牌,注明:细胞名称,冻存日期,以便日后查找。

5、冻存

当前已有专用细胞冻存器,在无冻存器的情况下,可用手工办法。从把冻存物悬在液氮罐口开始算起,按-1 ℃分钟速度,在30-40 分钟内,下降到液氮面,再停30 分钟后,直投入液氮中。

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